求助通用引物验证阳性克隆
聊了这么多，通用引物验证阳性克隆是一种基于PCR技术的有效技巧，通过设计针对载体通用序列的引物，可以快速、准确地鉴定出含有目的基因的阳性克隆。在实际应用中，需要注意各种影响影响，并进行相应的优化和调整。
做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F， M13R；M13F（-47）， M13R（-48）配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。
菌落PCR。设计引物扩增质粒特有的目的片段，如果阳性克隆里面有改片段，则说明转化成功。2 快抽质粒。将阳性菌落划平板，多少小时后，富集菌，接着快速抽提。看质粒大致有没有插入目的片段。3 提质粒，酶切鉴定。4 提质粒测序。1，2 都是早期的快速鉴定，假阳性高；3，4慢，然而比较确信。
导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长，而不含报告基因的大肠杆菌（就是转化失败的）就不能生长。这样过了两三天后，在培养基上看见的菌落就是阳性科隆。这一经过就是阳性科隆筛选。一般选用的报告基因像青霉素抗性基因，链霉素抗性基因等等。
检测敲除效果并提取RNA，最终验证敲除基因是否有效。聊了这么多，sgRNA技术在实现细胞或准基因动物的基因编辑方面展现出强大的潜力，从引物设计到阳性克隆细胞筛选，每一个步骤都需精心操作。选择合适的技巧和策略，结合操作经验和创新思考，可有效进步编辑效率和成功率，为基因编辑研究和应用提供有力支持。
如果你用了插入片断特异的引物扩增，那么可能是你连接时加的目的片断过多，菌表面粘附了目的片段（我曾经在没有斑的地方蘸一下，也能P出目的带），因此很可能出现假阳性。
我要求5’到3’正向测序,为什么你们给我的序列是反的?
无论兄弟们指的可能是插入片段的路线，而我们并不清楚无论兄弟们的样品是怎样构建的。
T载体只是为了方便克隆的一个中间步骤，因此序列没有正反之分，后面还需要进一步酶切，连接到目标载体中。
在DNA合成经过中，为何会形成5端到3的路线，可以通过与测序原理类比来领会。在测序时，通常会将dNTP（脱氧核苷三磷酸）与ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）混合使用。ddNTP由于缺少一个磷酸基团，无法形成磷酸二酯键，导致合成链在此处终止。而使用标准的dNTP时，链可以继续延伸。
正向引物和反向引物是相对的，通常以一个双链DNA（上面的那条链）的上游结合部位称为正向引物，是从左到右的路线，也就是5-3的路线，而下面那条互补链的下游结合部位称为反向引物。
测序都是从5端进行的，正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序，通常两个路线测序结局经校读后完全一致才能认为得到可靠结局。生工测序结局一般都提供两个文档，一个是TEXT的序列文档，一个是用Chromas软件打开的ABI文档。寻找引物 比对，去除引物序列，找到目的片段。
我有一个基因片段老是正向连接到PMD18-T载体上,我现在想要它反向连接…
1、在插入序列2端用PCR连接上不同的酶切位点（和载体的位置相对），用酶处理PCR产物和载体，接着再连接就可以了。
2、可以用自己基因片段的引物，也可以用一个通用引物，一个自己目的片段引物。
质粒测序为什么反向可以,正向不行
无论兄弟们指的可能是插入片段的路线，而我们并不清楚无论兄弟们的样品是怎样构建的。
DNA 测序失败的缘故归纳起来有三种： 一是模板的缘故，模板的质量很重要，加入反应里的模板“量”并不很严格，然而模板“纯度”要求很高。这就是为什么商业测序公司通常要自已提取模板的缘故。控制好模板是进步测序成功率的关键影响。
T载体只是为了方便克隆的一个中间步骤，因此序列没有正反之分，后面还需要进一步酶切，连接到目标载体中。
第一步，看箭头：大多数质粒都会有箭头，箭头有两种解释。一种是转录路线，转录路线主要是由启动子开始的一个大箭头，是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的路线，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个路线。
m13r,m13f引物能扩增pet-28a上目的基因片段吗
不能。m13r和m13f引物不能用于扩增pet-28a上的目的基因片段。具体缘故如下：m13r和m13f是通用引物，常用于PCR扩增目的基因片段的验证。这些引物通常与载体上的特定序列相匹配，用于检测插入片段的正确性或者进行测序反应。它们不是针对特定基因设计的特异性引物，因此不能用于扩增pet-28a上的任何特定基因片段。
M13引物是用于识别并扩增某些特定DNA序列的短链核苷酸序列。在pGEM easy-T载体中，M13引物通常用于验证基因是否已成功克隆到载体上，以及用于测序分析。其中，正向引物M13F和反向引物M13R各自有着特定的序列，它们能够与载体上的特定区域结合，通过PCR技术来扩增目标DNA片段。
做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F， M13R；M13F（-47）， M13R（-48）配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。
这个，取决于你所测的片段的来源吧。Poly A很可能是RT-PCR中使用了Oligo d（T）的结局，当然也可能是DNA片段本身就含有一部分连续的A，还可能是测序公司的失误。你应该使用的是PCR后连接载体后扩增出的重组质粒进行测序的。这样M13F是从一侧对插入片段进行测序。
